El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, también conocido como prueba LAL, tiene tres métodos analíticos para determinar las endotoxinas bacterianas. Estas técnicas son: Gel-Clot, turbidimétrica y colorimétrica, y pueden utilizarse de forma cualitativa o cuantitativa.
- Gel-Clot
El método Gel-Clot o de gelificación cuenta la cantidad de gel que resulta de la reacción que tiene lugar en el lisado de amebocitos cuando hay endotoxinas. Las endotoxinas provocan una serie de reacciones en cadena en la hemolinfa del cangrejo que conducen a la coagulación de la proteína, una reacción que puede verse claramente por la creación del gel en el tubo de ensayo. Hay que invertir el tubo en el que se ha producido la reacción y confirmar que el gel creado después de este procedimiento sigue siendo distinto de la mezcla para concluir que la prueba de LAL ha dado un resultado positivo con este método.
Esta aplicación cualitativa de este método es ideal para las pruebas rápidas en las que es importante determinar si una muestra ha sido contaminada o no por bacterias. También es posible una aplicación semicuantitativa de esta tecnología. La cantidad de endotoxinas presentes en la muestra puede determinarse midiendo la cantidad de gel que se forma en el tubo de reacción.
- Turbidimétrico
Como ya se ha señalado, las endotoxinas bacterianas reaccionan con la hemolinfa de los cangrejos y hacen que parezca una proteína sólida, lo que provoca turbidez en la muestra. Aplicando la turbidimetría, un método espectrofotométrico, se aprovecha este hecho para detectar la presencia de endotoxinas. El enfoque turbidimétrico cinético es el que se emplea con más frecuencia en la industria para el control de calidad de las materias primas y los productos finales. Este método tiene la ventaja de ser más preciso que el método del coágulo de gel, ya que se puede medir la cinética de la reacción.
- Cromogénico
El enfoque cromogénico implica la adición de un agente revelador de color que permite cuantificar las endotoxinas mediante la observación de la absorbancia de la muestra. La P-nitroanilina, un reactivo cromóforo, se encuentra inicialmente en un estado incoloro, puesto que está unido a un péptido. La P-nitroanilina se libera en proporción a la cantidad de endotoxinas en la combinación como resultado de la interacción de las endotoxinas con el lisado de amebocitos.
Estos procedimientos se utilizan para calcular la concentración de endotoxinas mediante la construcción de una curva de calibración utilizando los datos de absorbancia. Los análisis pueden realizarse mediante el método de punto final, similar al enfoque turbidimétrico, o el método cinético, en el que se tienen en cuenta los datos de absorbancia de la muestra en varios puntos tras la adición del lisado. Cualquier molécula que absorba en longitudes de onda cercanas al máximo de absorción de la p-nitroanilina puede alterar los resultados del análisis, como ocurre con cualquier enfoque cromogénico. La muestra examinada debe estar libre de interferencias en la zona de medición.
